最初给群众先容一下，多样类型B细胞细胞绚丽物的抒发情况，见下图1，这有助于咱们后期对B细胞进行分型。

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图1 生发中心B细胞（GCB）、牵挂B细胞以及抗体分泌型B细胞的名义绚丽物[1]

接着给群众先容一下CD40/CD40L系统。CD40/CD40L系统最早由Banchereau等东谈主于1991年提议，当今已成为B细胞体外扩增和培养最常用的系统。其中，CD40属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家眷的一员，庸碌抒发于免疫细胞名义，包括B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，同期也抒发于上皮细胞、内皮细胞、血小板等非免疫细胞名义。CD40的配体CD40L也属于TNF家眷，主要抒发于活化的T细胞名义，尤其是活化的CD4+T细胞，此外皮活化的γδT细胞，NK细胞，血小板等的名义也有抒发。CD40/CD40L系统对B细胞的滋长发育具有贫穷作用。有征询报谈，它不错促进B细胞的存活和增殖，促进B细胞的分化，设备B细胞免疫球卵白类别的转机，扼制B细胞的凋一火。接下来咱们就来先容愚弄CD40/CD40L系统对东谈主B细胞进行体外扩增培养的纪律。01CD40/CD40L系统

一、CD40/CD40L系统用于B细胞体外扩增与培养施行要领如下[2]：

（1）6孔细胞培养板或者10 cm细胞培养皿事先过夜接种抒发CD154（CD40LLOW细胞系）的基质细胞，动作B细胞培养的滋补层细胞。（2）将B细胞接种至6孔板（2 mL/孔）或者10 cm培养皿（6 mL /皿）的饲养层细胞上，诊疗B细胞密度为100/cm2。（3）培养条款：R5培养基（含有5%东谈主血清、55 µM 2-巯基酒精、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠和1%MEM非必需氨基酸），并补充重组东谈主IL-2（50 ng/mL）、IL-4（10 ng/mL）、IL-21（10 ng/mL），和BAFF（10 ng/mL），承接培养B细胞8天，培养时分字据施行打算可进行改变。（4）在第4天和第6天，弃去一半旧培养基（幸免触碰底部细胞），并用预热的、含细胞因子的崭新R5培养基等量替换。当培养时分逾越8天时，须在第8天将B细胞挪动至新的饲养层细胞上，同样在挪动后的第4、6天等量替换培养基。（5）细胞培养完了后，网罗B细胞进行计数，并在液氮中冷冻保存待用。（6）此外，作家字据运转B细胞增殖能源学的成果，优化了B细胞的接种密度与B细胞培养时分的不竭。第0天初次接种的B细胞数分裂为1×104、2.5×103和1×103/孔时，可用于B细胞进行径期4、6和8天的培养；8天后，将B细胞加至新的饲养层细胞，此时为止B细胞数分裂为4×104、1×104、2.5×103和1×103/孔，可用于B细胞为期10、12、14和16天的培养。注：在该细胞培养体系中，细胞因子以及CD40（B细胞）-CD154（饲养层细胞）的相互作用不错促进运转/牵挂B细胞增殖、活化以及APC功能的取得。其中，IL-21可促进B细胞的大批增殖；B细胞激活因子BAFF是TNF家眷成员，促进B细胞的存活和熟悉，并可促进牵挂B细胞向浆细胞分化。IL-4和IL-21则对不同Ig亚型具有一样作用，可字据施行打算选拔性添加。

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图1 B细胞体外培养细胞形态学

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首页-盛 盈奥地板有限公司 0， 東莞三億鏈條五金有限公司 0， 祁连县能建托盘有限公司 0.9);letter-spacing: 0.544px;text-wrap: wrap;background-color: rgb(255， 255， 255);text-align: center;box-sizing: border-box;overflow-wrap: break-word;">图2 B细胞体外培养细胞分化情况

运转B细胞经该纪律进行体外分离培养后，取得激活表型，梗概灵验促进抗原呈递，并最终不错分化为分泌抗体的浆母细胞和浆细胞。具体发达为：B细胞名义MHC-Ⅱ分子，共刺激分子CD80和CD86抒发增多；B细胞名义抗体资历IgM→IgG的改变；牵挂B细胞联系的分化绚丽物CD27抒发增多；以及B细胞抗体分泌联系绚丽物CD138抒发增多。

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图3 B细胞体外促进T细胞增殖评价：该纪律不仅可用于运转B细胞的分离与体外扩增培养，还能灵验促进B细胞增殖和分化，增强B细胞向T细胞呈递抗原促进T细胞激活的功能。二、接着，给群众先容另一篇对于体外GCB细胞培养的系统，大致过程与决策一近似。施行要领如下[3]：

（1）40LB细胞的解决与放射（以下为10 cm细胞培养皿的操作要领）：10 mL 3T3培养基培养40LB细胞，每隔三天传一次代，不错体外握续培养1个月以上。

注：40LB细胞是一种踏实抒发CD40L和BAFF的BALB/C 3T3细胞。3T3培养基：高糖型DMEM，业务合作补充10% FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。

① 40LB细胞从液氮中解冻孵化告捷后，以5×106接种至细胞培养皿，大要2天不错长满；

② 弃去培养液，2 mL PBS洗涤细胞后，以胰酶-EDTA溶液消化细胞，室温条款下290 g离心5 min。

③ 弃上清，加3T3培养基重悬细胞，按下表接种至符合细胞培养板中，让细胞充分贴壁滋长。

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④ 以80 Gy的γ射线映照，扼制40LB细胞的增殖，用作后续的饲养层细胞。

（2）小鼠脾脏中B细胞的分离：该要领和后续从扁桃体均分离B细胞的过程近似，此处不再阐明，注释见下文或者参考文件[3]。

（3）体外GCB细胞培养：① 去除饲养层细胞的培养液，加入35 mL含1 ng/mL IL-4的B细胞培养基（RMPI-1640彻底培养基，含10% FBS，10 Mm HEPES，1 mM丙酮酸钠，5.5×10-5 M 2-巯基酒精，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），加入5 mL细胞悬液至培养皿，细胞接种密度见上表。置于37℃，5% CO2条款下培养4天。② 细胞网罗：留意吸去培养皿中细胞培养液，保留约0.5 cm高度的残液，网罗至离心管中。培养皿中加入4 mL MACS缓冲液，静置3-5 min至细胞散播，网罗该部分缓冲液。再用5 mL MACS缓冲液洗涤培养皿，一并网罗。

注：MACS缓冲液指的是含0.5% BSA以及2 mM EDTA的PBS溶液。

③ 细胞离心后弃上清，以10 mL B细胞培养基重悬细胞后进行计数。镜下不错不雅察到GCB细胞体积明显小于40LB细胞。

④ 将B细胞接种至新的饲养层细胞上，字据①中要领链接培养。

（4）饲养层细胞去除：① 在要领（3）操作②完成后可进行饲养层细胞去除。② 弃上清，加入260 μL含生物素象征的抗H-2Kd抗体，留意打匀后，置于室温条款下孵育20 min。③ 用10 mL MACS缓冲液洗涤细胞两次。④ 弃上清，加入50 μL链霉素颗粒以及100 μL MACS缓冲液，留意打匀后，置于室温条款下孵育20 min。

⑤ 过柱网罗细胞，用符合体积的B细胞培养基重悬细胞后进行计数。

评价：和纪律一，该纪律亦然愚弄CD40/CD40L系统来对B细胞进行体外扩增培养，然则该纪律还先容了后续饲养层细胞的去除要领，群众可字据施行打算自行选作念。02EBV促进B淋巴细胞改变三、愚弄EB病毒促进B淋巴细胞的改变旨趣：EB病毒是一种DNA病毒，初次于Burkitt淋巴瘤的淋巴母细胞系中发现。EBV具有高度的B细胞倾向性，可麇集B细胞名义的CD21受体（即补体C3d片断的受体），同期HLA-Ⅱ可动作其共受体。在体外感染B细胞后梗概刺激其握续滋长并设备长生化，从而酿成淋巴母细胞样细胞系（LCLs）。病毒改变后的LCLs具有淋巴母细胞和活化B细胞表型：高抒发B细胞活化象征物CD23、粘附分子（LFA1、LFA3、ICAM1）以及MHC-I类和II类分子。当今施行中最常用于产生LCLs的EBV菌株来自绒猴细胞系B95-8或者是Burkitt淋巴瘤Akata细胞株。愚弄EB病毒促进B淋巴细胞的改变施行要领大致如下[4]：（1）EBV上清制备（字据施行室现存条款，自主选拔A或B病毒的制备模式）A：愚弄B95-8细胞系制备病毒上清： B95-8细胞用RPMI-1640彻底培养基（含10

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